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Patologie e Terapie

Analisi ed esami speciali

Foto analisi ed esami speciali

 

Che cos'è un emocromo

L’esame emocromocitometrico rappresenta l’indagine indispensabile da effettuare per verificare la presenza di alterazioni primitive delle componenti del sangue, dovute a malattie dell’emopoiesi, o secondarie a malattie extra-emopoietiche. Per effettuarlo si preleva sangue venoso mediante puntura di una grossa vena, generalmente del braccio, direttamente immesso in una provetta contenente dell’anticoagulante e mantenuto a temperatura ambiente fino al momento dell’uso.
Con l’emocromo si possono determinare vari parametri, tra cui la concentrazione di emoglobina ed il livello delle diverse componenti corpuscolate del sangue periferico.
Oggi, nei moderni laboratori di analisi, si usano strumenti automatici che consentono l’esecuzione in serie di un numero notevole di esami in breve tempo, con la valutazione di una serie di indici che permettono al medico di stabilire se vi sono anomalie a carico delle componenti del sangue.
Tra le sigle e i parametri valutati con l’emocromo i più importanti sono:
Ht- ematocrito: esprime la valutazione della massa eritrocitaria in rapporto al volume di plasma.
Hb-concentrazione di emoglobina: esprime la quantità di emoglobina in grammi presenti in un litro di sangue. La lettura si effettua mediante apparecchi automatizzati, che sono in grado di determinare anche parametri quali MCHC (concentrazione emoglobinica corpuscolare media, espressa in gr/dl) e MCH (contenuto emoglobinico corpuscolare medio).
RBC o GR- red blood cells o globuli rossi: è il numero dei globuli rossi per litro di sangue. I globuli rossi contengono l’emoglobina, la proteina che trasporta ossigeno e anidride carbonica per lo scambio del metabolismo cellulare. Si formano nel midollo osseo.
MCV-volume corpuscolare medio: indica il volume medio dei globuli rossi.
WBC o GB-globuli bianchi: white blood cells o globuli bianchi e/o leucociti. E’ il numero dei globuli bianchi per litro di sangue. Si riconoscono diversi tipi:
  • neutrofili: difendono dalle infezioni batteriche.
  • eosinofili: difendono da infezioni parassitarie e aumentano in caso di allergia.
  • basofili: funzioni ancora non certe, contengono istamina.
  • monociti: intervengono nella difesa contro alcune infezioni batteriche come la tbc.
  • linfociti: si suddividono in linfociti B, T; i B sono deputati alla produzione di anticorpi, i T intervengono nelle infezioni di tipo virale e nel riconoscimento specifico di cellule estranee (anche nei trapianti).
Plts-piastrine: o trombociti, indica il numero di piastrine presenti nel campione esaminato. Queste sono fondamentali nel complesso processo della coagulazione.
Negli strumenti computerizzati, il conteggio è effettuato secondo lo strumento impiegato. In alcuni ad esempio viene sfruttato l’aumento di impedenza elettrica che le cellule, povere in conduzione di elettricità, generano nel passaggio attraverso una apertura in un campo elettrico; in altri invece vengono registrate le modificazioni di intensità luminosa di un raggio rifratto, mediante luce bianca o laser.
Mediante queste tecniche, con i più recenti apparecchi sono forniti anche altri parametri eritrocitari. Infatti l’RDW (ampiezza della distribuzione eritrocitaria) misura l’eterogeneità nel volume dei globuli rossi, misurando così l’anisocitosi.
Altri apparecchi danno anche una misurazione non solo numerica, ma anche semiquantitativa della micro- o macrocitosi, ovvero delle minori o maggiori dimensioni dei globuli rossi.
Sulle curve di distribuzione dell’emoglobina, si valuta la concentrazione interna di questa e si misura l’ipocromia (globuli rossi con zona centrale più pallida e quindi meno colorata) o l’ipercromia (globuli rossi ipercolorati). La poichilocitosi è invece la variazione del contorno del globulo rosso, come accade in alcune forme di anemie (ad es. le emazie a falce della drepanocitosi).
I nuovi apparecchi automatici inoltre misurano dei parametri anche per le piastrine, come il PDW (grado di anisocitosi o variazione di ampiezza piastrinica) e il MPV (volume piastrinico medio).
Nella diagnostica delle anemie è molto utile il conteggio dei reticolociti, cioè degli eritrociti giovani, che contengono nel loro interno residui di acido nucleico. Oltre che con i metodi tradizionali, quali le colorazioni con il blu di metilene o con il blu brillante di cresile, è possibile ora contarli con metodo automatico mediante l’uso di coloranti legati a fluorocromi, cioè a sostanze fluorescenti. E’ così possibile individuare e contare i reticolociti in valore percentuale, suddividendoli in tre popolazioni: a bassa, media ed alta fluorescenza.

Esame morfologico del sangue venoso periferico

E’ indispensabile per una corretta valutazione diagnostica in campo ematologico. Consente infatti di osservare eventuali anomalie dei globuli rossi, bianchi e delle piastrine, eventuali variazioni della formula leucocitaria con la presenza o meno di cellule immature.
Per l’esecuzione dello striscio può essere utilizzato sangue intero o contenente anticoagulante della provetta; la colorazione si effettua con la metodica di May-Grunwald-Giemsa nei paesi europei, mentre negli Stati Uniti si utilizza la colorazione di Wright.
L’esame microscopico si effettua inizialmente a piccolo ingrandimento per una valutazione globale del preparato, che ci indica la leggibilità e la distribuzione dei leucociti e delle piastrine. Poi con un maggiore ingrandimento è possibile individuare le modificazioni di forma e di dimensioni dei globuli rossi, la morfologia dei leucociti con la valutazione della formula leucocitaria e la eventuale presenza di cellule anomale. Inoltre è possibile valutare la presenza di piastrine, la morfologia di queste e la possibile presenza di aggregati.
 
Alcuni esempi di morfologia dei globuli rossi
Normalità: forma biconcava con contorni lisci e maggiormente colorati in periferia con alone centrale più chiaro.
Variazioni di forma e dimensioni: valutazione della anisocitosi e della poichilocitosi (vedi par.1). Riscontro di alcune forme caratteristiche quali i dacriociti (emazie a lacrima) come nel caso di focolai di emopoiesi extra-midollari (patognomonici della mielofibrosi); ellissociti ed ovalociti (emazie ovali) si possono riscontrare nelle anemie da carenza vitaminica, nella mielofibrosi ma soprattutto nell’ellissocitosi ed ovalocitosi ereditaria (patologie di membrana del globulo rosso).
Il termine macrocitosi indica un aumento del volume del globulo rosso come accade in condizioni di carenze vitaminiche, nell’anemia aplastica o nelle anemie diseritropoietiche. La microcitosi al contrario, indica una diminuzione del volume cellulare come nel caso dell’anemia da carenza di ferro nelle talassemie.
Inadeguata sintesi di emoglobina: ipocromasia quando i globuli rossi sono più pallidi per riduzione della sintesi dell’eme o della globina (ad es. anemie da carenza di ferro). Si ha invece ipercromasia quando i globuli rossi sono colorati di più per aumento del loro spessore come nel caso delle anemie da carenze vitaminiche o nel caso della sferocitosi ereditaria.
Danno periferico: il fenomeno della sferocitosi (forma sferica del globulo rosso con aumento dello spessore) si può avere in forme emolitiche come nel caso di un difetto genetico di membrana (sferocitosi ereditaria) o, quando la superficie del globulo rosso interagisce per la presenza di immunoglobuline sulla superficie (anemie emolitiche autoimmuni).
Schistocitosi è il fenomeno per cui si osservano frammenti di globuli rossi, come avviene nelle talassemie o nelle anemie carenziali, ma soprattutto in condizioni di stress meccanico (anemie emolitiche microangiopatiche) o nella porpora trombotica trombocitopenica (sindrome di Moschowitz).
Altre anomalie dei globuli rossi: cellule a bersaglio (quando è colorata anche una area centrale) come nel caso delle talassemie; drepanociti (emazie a falce) per l’alterazione della sintesi dell’emoglobina, assumono questa tipica forma a falce o semiluna; echinociti, quando sulla superficie sono presenti dei rilievi spinosi (come nel caso dell’insufficienza renale) o acantociti, con rilievi più grossolani come nel caso di un alterato metabolismo fosfolipidico. Gli stomatociti, quando la parte centrale è ridotta ad una sottile fessura, come nelle condizioni emolitiche ereditarie.
 
Morfologia piastrinica
Con l’esame dello striscio si possono valutare: il numero, le dimensioni, la morfologia ed il fenomeno degli aggregati piastrinici.
I megatrombociti si riscontrano in diverse patologie congenite o non, che riguardano sia le piastrine (sindrome di Bernard-Soulier, piastrinopenia autoimmune, sindrome di Moschowitz, etc.) che il sistema emopoietico (sindromi mielodisplastiche, sindromi mieloproliferative croniche, etc.).
Gli aggregati piastrinici possono essere espressione di un’alterazione legata all’anticoagulante presente nelle provette (EDTA), che causa una falsa riduzione del numero delle piastrine.
 
Alcuni cenni sulla morfologia dei leucociti
Con il piccolo ingrandimento del microscopio si inizia generalmente dando una stima del numero e della formula leucocitaria.
Si riscontrano poi le eventuali anomalie nucleari e/o citoplasmatiche e la presenza di cellule immature; un esempio di anomalia nucleare è per esempio l’ipersegmentazione del nucleo che si riscontra nei neutrofili nel caso di un’anemia da carenza vitaminica. Anomalie del citoplasma si riscontrano ad esempio nelle sindromi mielodisplastiche (degranulazione, presenza di granulazioni anomale) o nelle infezioni (ipergranulazione, vacuolizzazione).
La presenza di un monomorfismo è indicativo di un processo leucemico acuto, mentre invece uno sbilanciamento verso la linea mieloide con una leucocitosi può essere indice di un processo leucemico cronico o di una reazione leucemoide (leucocitosi di solito legata ad un processo infettivo, ad una neoplasia invasiva o ad iperemolisi acuta); uno sbilanciamento verso la linea linfatica, con aumento dei linfociti può essere espressione di una leucemia linfatica cronica o di un processo infettivo virale.

L'agoaspirato midollare e la biopsia ossea

L’esame del midollo osseo trova indicazione in tutte le condizioni in cui si sospetti una compromissione primitiva o secondaria dell’emopoiesi.
Nel midollo osseo sono contenuti i progenitori o precursori dei globuli rossi (eritroblasti), dei globuli bianchi (granuloblasti, differenti precursori che maturano con fasi maturative distinte a seconda del tipo), delle piastrine (megacariociti).
L’esame microscopico del midollo consente la valutazione morfologica, citochimica e fenotipica delle singole cellule ed è indispensabile per la classificazione di alcune condizioni ematologiche come le leucemie acute e le sindromi mielodisplastiche.

  • L’aspirato midollare consiste nel prelievo di sangue midollare. Per il prelievo si utilizza un ago corto, robusto ed affilato che possiede ad una estremità un fermo regolabile ed è attraversato da un mandrino. Le sedi utilizzate per il prelievo, che usualmente è eseguito dopo anestesia locale, sono:
    - cresta iliaca posteriore (parte posteriore del bacino) a qualsiasi età.
    - sterno (torace anteriore)
    - cresta iliaca anteriore (parte anteriore del bacino), nei bambini.
    L’aspirazione è breve, necessaria a prelevare una piccola quantità di sangue midollare; la manovra, anche se fastidiosa, non è generalmente molto dolorosa.
    Il materiale aspirato viene posto su dei vetrini e strisciato. Dopo la colorazione e la asciugatura, si può osservare al microscopio valutando la cellularità e ricercando a piccolo ingrandimento la presenza dei megacariociti e la loro funzionalità; la presenza di cluster (raggruppamenti) di cellule estranee al midollo e la presenza di monomorfismo cellulare.
    A grande ingrandimento si ricercano poi le eventuali anomalie morfologiche delle tre serie emopoietiche (eritroblasti, granuloblasti e megacariociti).

 

  • La biopsia ossea consiste nel prelievo di un frammento di tessuto osseo che contiene il midollo (frammento osseo) che, a differenza dell’aspirato midollare, permette di valutare la densità cellulare, l’insieme del tessuto emopoietico ed il rapporto delle cellule con lo stroma (tessuto di sostegno del midollo) e la eventuale presenza di infiltrazione da parte di cellule estranee. Il prelievo si esegue sulla cresta iliaca posteriore, dopo aver anestetizzato la cute e il tessuto osseo sottostante (si può eseguire anche con anestesia generale). Si inserisce un ago di maggior calibro (ago di Yashmidi) nella profondità dell’osso per un paio di centimetri e si ritira lo strumento all’interno del quale rimane un piccolo frammento cilindrico di tessuto. Il frammento può essere fissato in formalina poi sezionato e valutato da un patologo particolarmente esperto nelle malattie ematologiche.
    La procedura non è molto dolorosa: si può eseguire in regime ambulatoriale o di Day-Hospital, così che il paziente può tornare a casa dopo l’esecuzione.
    Tra le complicanze possibili, ma molto rare sono eventuali ematomi nella sede del prelievo; ancora più rare sono le lesioni ossee o le infezioni nella sede della puntura.

 

la biologia molecolare

La biologia molecolare è una branca recente della biologia. Essa studia, grazie all’uso di tecniche peculiari la struttura e le funzioni del DNA (acido desossiribonucleico) e la formazione di proteine che derivano dai processi di traduzione di questo.
Alla base di tutto ci sono le proprietà della doppia elica del DNA e la possibilità di ibridizzare queste, cioè creare un tratto, una sequenza di DNA che sia complementare alla zona del DNA che cerchiamo. A questo punto si utilizza una sonda molecolare marcata con un isotopo radioattivo che permette l’identificazione del tratto di DNA ricercato. Questa metodica, permette di individuare la presenza di determinate sequenze di DNA all’interno delle cellule o di localizzarne altre sui cromosomi.
 
Le metodiche utilizzate in biologia molecolare sono il Southern blot e la polymerase chain reaction o PCR: con la prima il DNA digerito da processi enzimatici, che permettono così la visione del tratto di DNA interessato, viene fatto correre con il principio dell’elettroforesi su un gel mediante un campo elettrico. Successivamente la sonda marcata si lega al tratto ricercato se presente e con un metodo di autoradiografia è possibile evidenziarlo.
 
La seconda metodica permette di amplificare anche piccoli tratti di DNA ed individuare la lesione molecolare anche con la presenza di poche cellule.
Le indicazioni della biologia molecolare sono: nella diagnostica prenatale e nella diagnostica onco-ematologica. In quest’ultima, le tecniche di biologia molecolare sono divenute di complemento alle tecniche di morfologia, immunologia e citogenetica.
Le malattie nelle quali si applica di routine sono le leucemie acute (specie il tipo promielocitico), la leucemia mieloide cronica e le malattie linfoproliferative croniche.
 
L’identificazione degli eventi molecolari di una patologia ematologica, permettono di:
  • definire differenti sottotipi di leucemia o linfoma con caratteristiche cliniche ben definite ed una prevedibile risposta alla terapia.
  • riconoscere il target (bersaglio) della lesione molecolare per indirizzare nuove terapie mirate (ad es. immunoterapia).
Con l’avvento di queste metodiche sempre più perfezionate, sono sorte anche delle indicazioni terapeutiche diverse; ad esempio, il riconoscimento dell’evento molecolare della leucemia acuta promielocitica, il trascritto PML/RAR alfa tipico di questa varietà di leucemia. Attualmente si parla di remissione molecolare, indicando così la scomparsa completa di questo trascritto evidenziabile con metodiche quali la PCR che permette di osservare la presenza di cellule nell’ordine di 10-4 e di recidiva molecolare indicando così il ripresentarsi della malattia dopo aver ottenuto una remissione molecolare. Studi recenti hanno dimostrato un vantaggio di sopravvivenza nei pazienti che vengono trattati in recidiva molecolare, piuttosto che quando la recidiva è morfologica.

la caratterizzazione immunologiche

L’importanza della citofluorimetria nel campo onco-ematologico è andata aumentando negli ultimi decenni in particolare nel campo delle leucemie acute.
Si basa sulla possibilità di riconoscere con delle metodiche di marcatura con immunoglobuline legate a sostanze colorate (fluorocromi), la presenza di antigeni specifici di linea esposti sulla membrana (marcatura di superficie) o di antigeni intracitoplasmatici o endo-nucleari.
Il campione di sangue midollare o periferico, una volta incubato con queste sostanze, viene fatto passare all’interno di una macchina, detta analizzatore di flusso, che permette di leggere la fluorescenza della cellula marcata e la densità di quel particolare antigene che cerchiamo.
La strategia nell’analizzare diversi tipi di patologia, consiste nel formare una porta (“gate”) attraverso cui selezionare solo la popolazione interessata.
 
Gli obiettivi di una analisi citofluorimetrica sono:
  • quantizzare la popolazione patologica e stimare la quota residua normale.
  • porre diagnosi di forma cronica o acuta in base all’espressione di alcuni antigeni caratteristici, sulla base del livello di maturazione di questi, in maniera concorde con l’analisi microscopica.
  • ricerca di forme a carattere prognostico favorevole e/o sfavorevole
  • ricerca di marcatori aberranti, allo scopo di valutare, in remissione morfologica, la malattia minima residua.
A questo scopo si utilizzano sistemi di doppia o tripla marcatura, che consentono di monitorizzare e caratterizzare le cellule neoplastiche.

lo studio del cariotipo in ematologia

Studia la presenza di eventuali alterazioni cromosomiche associate alle patologie ematologiche neoplastiche.
Con l’avvento di nuove tecniche negli ultimi decenni, è stato possibile identificare in maniera più precisa i cromosomi e le singole regioni dei cromosomi. Questo ha permesso di associare in maniera più selettiva e specifica alcune alterazioni cromosomiche ad alcune patologie oncoematologiche.
 
Questo aiuta il clinico nella formulazione della diagnosi e nella classificazione delle leucemie, dei linfomi e delle patologie leucemiche croniche.
Consente inoltre di valutare l’evoluzione della patologia, da indicazioni prognostiche e modula la possibilità di creare strategie terapeutiche.
L’analisi cromosomica si effettua sul tessuto considerato interessato dalla patologia ematologica (il midollo osseo nelle leucemie ed il linfonodo nei linfomi).
Le alterazioni del cariotipo indicano la sede della lesione molecolare che può aver concorso alla formazione del processo neoplastico.
 
Considerando che i cromosomi normali umani sono divisi in 22 paia più la coppia dei cromosomi sessuali X e Y, in termini citogenetici si parla di alterazioni numeriche, quando vi è presente solo un cromosoma della coppia (monosomia), quando uno dei due è duplicato (trisomia); iperdiploidia, quando la cellula osservata che si divide contiene più di 46 cromosomi; ipodiploide, se ne contiene meno di 46; polidiploide, se contiene un multiplo di cromosomi.
 
Si parla invece di alterazioni strutturali, quando vi è:
  • delezione: perdita di una parte di un cromosoma;
  • traslocazione: è il trasferimento di un segmento cromosomico da un cromosoma all’altro.
  • inversione: un segmento cromosomico è invertito rispetto alla sua situazione normale; etc.
Le traslocazioni ad esempio creano dei meccanismi complessi che possono essere responsabili di mutazioni dei geni interessati attraverso diversi meccanismi:
  1. la giustapposizione dei due cromosomi può creare un gene di fusione con particolare funzionalità: è il caso della leucemia mieloide cronica, in cui la traslocazione dei cromosomi 9 e 22 permette la formazione di un gene di fusione detto BCR/ABL che a sua volta permette la formazione di una proteina dotata di un particolare effetto metabolico a livello delle cellule che si replicano. La scoperta di questo meccanismo, ha permesso l’impiego moderno di farmaci che bloccano questa proteina ed il complicato meccanismo metabolico e biologico che ne consegue.
  2. Altre volte il posizionamento di un fattore “oncogenico”, (cioè che può essere implicato nel meccanismo di regolazione della vita cellulare e una volta alterato nella formazione della neoplasia) vicino a zone particolarmente attive di altri cromosomi, fa si che il primo venga tradotto in maniera aberrante, creando uno squilibrio e la formazione del primum movens (processo leucemogenico). E’ il caso delle traslocazioni che coinvolgono il cromosoma 8 a livello di un oncogene detto c-myc: nella forme leucemiche linfoidi queste possono coinvolgere i cromosomi 2, 14, e 22, dove si replicano attivamente i geni per la formazione delle immunoglobuline. In questa maniera il c-myc viene tradotto in maniera aberrante ed influenza il metabolismo cellulare, innescando il processo neoplastico.
L’identificazione delle alterazioni citogenetiche è divenuta di grande utilità nella classificazione e successiva scelta della strategia terapeutica nelle leucemie acute mieloidi e nell’individuazione di alcune forme particolari di leucemia acuta e di sindromi mielodisplastiche.

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